分子POCT技术介绍

POCT是即时检测（Point of Care Testing）的简称，指通过现场采样、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到结果的一种检测方式。WHO在2006年要求建立的POCT方法应符合ASSURED标准，即可承担(Affordable)、灵敏度高(Sensitive)、特异性好(Specific)、操作友好(User-friendly)、快速并可重复(Rapid and Robust)、无需仪器(Equipment-free)和易获取(Delivered to the end user)。随着技术更新和需求变化，2019年补充了实时通信（Real-time connectivity）和样本采集便捷（Ease of specimen collection），即REASSURED标准。

与传统方法相比（图1），POCT以其仪器小型便捷、样本周转时间短、操作简单的特有优势，深受用户的欢迎并逐渐广泛使用，在包括重大疫情监控、慢病监测、传染病检测、现场执法检测、医学救援、海关检验检疫、食品安全、毒品检验等卫生领域，承担了现场检验的重任。

图1POCT与传统检测的区别

一、POCT介绍

常用的POCT技术早期主要以定性检测为主，包括干化学、胶体金、免疫层析等。随着研究的进展以及对检测需求的逐步提升，以免疫荧光、化学发光、微流控等技术为核心的POCT产品快速发展并率先应用于临床，实现了快速的定量检测并提高了准确性(图2）。目前，POCT 不仅用于血糖检测和早期妊娠的检测，还广泛应用于心血管疾病、急慢性肾病、感染性疾病、凝血检测、药物浓度监测等方面。使用场所也从医疗机构中门急诊、ICU逐步向家庭、海关、基层机构和诊所等延伸领域，并扩展到食品卫生、环境检测、禁毒、法医等领域。

图2POCT技术发展历程

二、分子POCT技术

随着分子诊断技术的发展，其快速、精准、高效的特点，被广泛应用于病原体检测、肿瘤、遗传病等领域，特别是对难以培养、生长缓慢、罕见或新发再现病原体检测方面均表现出明显优势。但常规核酸检测方法对人员专业素质要求高、设备复杂、测试周期较长，对儿科、重症感染的病原学确诊往往滞后，有效缩短等待时间和诊疗时间已成为当前的迫切需求。

分子POCT平台结合了即时检测和分子生物学技术的特点，在实现“提取-扩增-检测”整合一体化的同时，兼具便携、操作简易、快速、密闭性好的特点，同时保持高特异性和敏感性。分子POCT省去了基因扩增实验室分区的要求和大型仪器设备检测的步骤，也简化了数据处理等繁琐过程，可直接快速地得到可靠的结果用于指导患者治疗，虽仍然不能脱离基因扩增实验室，但随着新技术/新方法的出现，这部分限制被逐渐解决，为院内感染诊治和居家自测的疾病管理，提供了重要技术支撑和保障。

目前开发的分子POCT诊断产品多应用于病毒检测（新冠、流感病毒A/B、合胞病毒、HIV、HBV、HCV等）、细菌耐药检测（结核分支杆菌及利福平耐药、多重耐药菌CRE）、STD（沙眼衣原体、淋球菌、GBS等）、症候群检测（腹泻症候群、血流感染症候群、中枢神经感染症候群等）以及肿瘤基因检测。(表1)中罗列了市场上常见的分子POCT企业，方法学多采用PCR和恒温扩增的方法，在样本采集、产品形态和结果报告都有各自的特点，后续也会有更多的产品落地。

表1 分子POCT代表性平台和产品

三、基于CRISPR技术的分子POCT介绍

以基于CRISPR为代表的新型诊断技术逐步开发成功。不同于前面介绍的PCR和恒温技术，该技术依赖Cas蛋白/sgRNA复合物精准识别和剪切目标基因，同时会非特异的、持续的切割带有荧光基团和猝灭基团的报告分子（即反式切割），并释放大量荧光信号，达到检测的目的。持续的反式剪切带来的高灵敏度，精准识别的高特异性，大幅降低了恒温扩增的假阳性风险，且不依赖于复杂或大型的设备，给诊断发展提供了新的方式。自从2016年发现反式切割活性以来，6年间已有多个蛋白Cas9、Cas 12a、Cas 12b、Cas 13a和Cas 14等多种效应蛋白被证明均具有该活性（图3），基于上述特点，CRISPR/Cas系统在分子POCT中展现出极大的应用前景。

图3基于CRISPR/Cas核酸检测的诊断方法的里程碑时间表

随着新冠疫情的流行，极大的推动了CRISPR检测方案的产业化的进程，包括张峰团队的SHERLOCK公司和詹妮弗·杜德纳的Mammoth公司都获得了FDA的紧急授权，国内的杭州众测和上海伯杰也都基于该技术获得了NMPA注册，产品形态多以双反应管的形式，恒温扩增和CRISPR检测过程中需开盖，操作仍较复杂且存在较高的气溶胶污染的风险。SHERLOCK、Proof diagnostics和国内的江苏为真、迅识生物都在开发基于CRISPR技术的分子POCT的产品（表2），通过芯片或层析方式整合，操作更加简便，在更短的时间内完成检测，同时减少污染的风险。同时，迅识生物依托于CRISPR底层专利技术，利用Cas12b蛋白性能优异且有较宽的反应温度的特点，除去正在开发面向医疗机构的诊断试剂外，还在积极推进针对疾控和海关口岸等需求的产品研究，预期该平台能够覆盖多个领域。

表2 基于CRISPR检测技术的分子POCT平台

四、总结

基于QPCR、恒温扩增和CRISPR等技术的POCT平台，通过荧光、比色法、电化学等多种检测模式，为现场即时诊断提供了新技术、新方法，未来仍将在准确性、成本控制、检测时间、指标数量、检测通量、产品易用性上继续优化。同时，在不断完善质量控制的前提下，持续带动检测需求，拓宽应用场景，在提升国家医疗质量安全、公共卫生紧急应对以及建立分级诊疗、远程医疗和移动检测模式等方面提供有力支持。

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